蛋白质表达以后，在发挥真正功能之前，会经过多种不同的翻译后修饰，例如，磷酸化，乙酰化，糖基化等基团修饰。本文主要讲下两种研究蛋白磷酸化修饰的方法：Western Blot和质谱检测法。

蛋白质翻译后修饰种类

蛋白磷酸化修饰过程

蛋白磷酸化修饰这一过程是通过蛋白激酶催化，将磷酸基团从ATP转移到多肽底物的丝氨酸、苏氨酸，或酪氨酸残基上。并且磷酸化修饰的过程是可逆的，去磷酸化反应由蛋白磷酸酶催化完成。

蛋白质磷酸化修饰反应过程

蛋白磷酸化检测方法

目前，蛋白磷酸化的检测方法有很多种，本文将着重讲解两种检测蛋白磷酸化的方法：Western Blot和质谱分析法。

一 、Western Blot检测方法

Western Blot是检测蛋白磷酸化水平的常用方法，主要过程为先利用SDS-PAGE分离蛋白质，随后将蛋白质转移到PVDF膜上，然后使用特异性识别磷酸化蛋白的抗体来鉴定目标蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量的地方显现特异性蛋白条带。

Western Blot实验过程

Western Blot蛋白磷酸化检测结果

Western Blot检测方法优势：

• WB方法简便，多数实验室具备Western Blot设备条件。
• 许多磷酸化抗体十分灵敏，能够检测低至10ug的蛋白样品。
• 对于丰度低的蛋白，可以先通过IP使用目标蛋白的抗体对目标蛋白进行富集，再进行WB检测被磷酸化的蛋白，检测效率可以提高几倍甚至几十倍。

Western Blot检测方法缺点：

• 特异性磷酸化抗体难以制备，许多特异性位点的磷酸化检测受限。
• 测定的磷酸化水平受样品处理和凝胶上样的误差影响。
• 同时获取多个蛋白质磷酸化的位点信息会受限。

二、质谱检测方法

Western Blot的方法虽然简便，但是对于大规模分析复杂的生物样品的磷酸化水平就不再适用了。而质谱却能很好的解决这一问题。依靠高精准度质谱仪，如今快速准确分析细胞中高丰度蛋白的磷酸化修饰已是非常简单的事。具体的检测方法为先通过SDS-PAGE胶，或者2D-PAGE胶等分离目标蛋白，将含有目标蛋白的条带切下，胰酶消化，LC-MS/MS检测分析蛋白序列和相应位点的磷酸化修饰。这个方法适用于同时检测多个目标蛋白的磷酸化水平。此外，对于磷酸化丰度相对较低的目标蛋白，我们也能采取像下图中固定化金属亲和层析IMAC等方法来富集磷酸化的肽段，再使用质谱对富集的蛋白进行分析。

磷酸化蛋白富集和质谱检测

质谱检测方法优势：

• 精准度高，能够同时检测多个蛋白的多个磷酸化位点。
• 适用于大规模分析蛋白磷酸化水平。
• 不依赖于磷酸化抗体。

质谱检测方法缺点：

• 设备要求较高，通常需要借助专业质谱分析机构。
• 测序结果分析相对复杂，需要依赖专业分析软件，以及生物信息技术平台。

在实际应用中，Western Blot与质谱分析方法各有各的好，谁也无法完全被另一种方法所替代。所以在选择测定磷酸化修饰的时候还应该根据具体需要来决定。如果研究的蛋白正好有商业化的磷酸化抗体，那么lucky you，你可以选择Western Blot进行快速磷酸化测定研究。但是如果你所研究的蛋白质没有可用的商业化磷酸抗体，或是抗体价效过低，亦或是需要大规模地检测细胞内磷酸化蛋白的水平的话，质谱检测会是更好地选择。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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